Ocena użytkowników: 0 / 5

Gwiazdka nieaktywnaGwiazdka nieaktywnaGwiazdka nieaktywnaGwiazdka nieaktywnaGwiazdka nieaktywna
 

Zastosowanie związków boronowych w detekcji sacharydów

Karolina Gluza

Zakład Chemii Bioorganicznej, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska

Kwasy boronowe stanowią grupę związków organicznych, zawierających elektronodeficytowy atom boru związany z dwoma grupami hydroksylowymi oraz podstawnikiem alkilowym lub też arylowym. Związki boronowe zdolne są do tworzenia odwracalnych wiązań kowalencyjnych z molekułami zawierającymi ugrupowania 1,2- oraz 1,3-diolowe w rezultacie prowadząc do powstawania pięcio- lub też sześcioczłonowych cyklicznych estrów boronowych. Ta szczególna właściwość pozwala na wykorzystanie ich jako specyficznych i selektywnych chemoreceptorów dla związków biologicznie czynnych takich jak cukry, glikoproteiny czy też katecholaminy. Odpowiednio funkcjonalizowane kwasy boronowe znajdują coraz szersze zastosowanie w chemii medycznej i farmaceutycznej do konstrukcji czipów diagnostycznych lub testów kolorymetrycznych pozwalających w łatwy sposób monitorować poziom glukozy u osób dotkniętych cukrzycą.


Słowa kluczowe: kwasy boronowe, rozpoznawanie cukrów, detekcja glukozy

Nieustanny rozwój chorób cywilizacyjnych sparawia, iż jednym z głównych celów współczesnej diagnostyki medycznej staje się opracowanie szybkich i selektywnych testów, pozwalających na wykrycie stanu chorobowego już we wczesnych etapach jego rozwoju. Obecnie w celu detekcji i identyfikacji stanów patologicznych, w oragniźmie pacjenta, stosuje się testy enzymatyczne oraz mikromacierze DNA. Techniki te ułatwiają postawienie trafnej diagnozy oraz dostosowanie leczenia do indywidualnych potrzeb osoby dotkniętej konkretnym schorzeniem. Znaczny koszt i czas takiego badania sprawia, iż coraz większym zainteresowaniem zaczynają się cieszyć czipy diagnostyczne pozwalające na powiązanie reakcji bibliotek cząsteczek lub białek ze składnikami występującymi w ekstraktach tkankowych lub płynach fizjologicznych. Takie biblioteki konstruuje się wykorystując, miedzy innymi, syntetyczne receptory. Odpowiednimi kandydatami mogą być kwasy boronowe stanowiące klasę związków organicznych zdolnych do tworzenia odwracalnych wiązań kowalencyjnych z analitami zawierającymi ugrupowania 1,2- oraz 1,3-dihydroksylowe [1], tworząc z nimi cykliczne estry. Ta szczególna właściwość chemiczna kwasów boronowych sprawia, iż od wielu lat są one stosowane jako efektywne narzędzia służące do rozdzielania i ilościowego określania poziomu niskocząsteczkowych cukrów i katecholi obecnych w płynach ustrojowych.
Ogromna różnorodność sacharydów sprawia, iż konieczne staje się poszukiwanie nowych receptorów, gwarantujących większą specyficzność względem wiązanych substratów. Dotychczas udało opracować się wiele układów oparych o strukturę kwasów boronowych zdolnych do detekcji cukrów [2]. Szczególną uwagę poświęcono receptorom mogącym wiązać selektywnie glukozę, której stężenie odgrywa kluczową rolę w profilaktyce i kontroli cukrzycy.

Mechanizm działania kwasów boronowych
Kwasy boronowe znajdują szerokie zastosowanie w wielu dziedzinach nauki takich jak chemia (użyteczne substraty w syntezie organicznej), farmacja (detekcja poziomu cukrów we krwi) czy też medycyna (srodki przeciw-nowotworowe).
Pomimo wieloletnich badań nad mechanizmem tworzenia estrów boronowych, istnieje wciąż wiele niejasności dotyczących przebiegu tej reakcji oraz czynników wpływających jej przebieg. Obecnie przyjmuje się, że wiązanie dioli z kwasami boronowymi przebiega dwuetapowo, z utworzeniem produktu przejściowego w postaci monoestru. Największe kontrowersje dotyczącą jednak tego, która z możliwych form kwasu boronowego - trygonalna czy też tetraedryczna jest bardziej reaktywna względem związków polihydr3oksylowych. Z najnowszych doniesień literaturowych wynika, iż atom boru w postaci trygonalnej jest 5-krotnie bardziej reaktywny od anionu boranowego [3].
Bez względu na proponowany mechanizm, niekatalizowana reakcja kompleksowania rozpoczyna się nukleofilowym atakiem wolnej pary elektronowej atomu tlenu diolu na nieobsadzony orbital p boru. Prowadzi to do utworzenia wiązania B-O z jednoczesnym przeniesieniem protonu na grupę hydroksylową kwasu boronowego. Podczas reorganizacji substratów do czteroczłonowego stanu przejścio-wego atom boru zmienia hybrydyzację z sp2 na sp3. Jest to proces synchroniczny, w wyniku którego powstaje monoester, cząsteczka wody, oraz następuje odtworzenie się wolnego orbitalu p na atomie boru. Drugi etap jest analogiczny do pierwszego i w rezultacie prowadzi do powstania cyklicznego estru boronowego [4].
W środowisku wodnym reakcja kompleksowania może być katalizowana przez cząsteczki wody, która może pełnić rolę równocześnie akceptora jak i donora protonu. Utworzony w ten sposób stan sześcioczłonowy stan przejściowy jest bardziej stabilny termodynamicznie w odniesieniu do mechanizmu niekatalizowanego [2].


Receptory dla sacharydów
In vivo sacharydy nie wykazują właściwości fluorescencyjnych ani chromoforowych, dlatego niemożliwe jest ich bezpośrednie oznaczanie w płynach fizjologicznych. W związku z tym otrzymywanie selektywnych chemoreceptorów dających odpowiedź po związaniu się z wybranym cukrem jest konieczne z punktu widzenia współczesnej diagnostyki medycznej. Ze względu na ogromną różnorodność sacharydów oraz fakt, że istnieniją one w dynamicznych formach równowagowych w roztworze, nie jest to trywialne zadanie. Przykładami tych równowag moga być: mutarotacja, występowanie cukru w formie piranozowej i furanozowej, a te formy występują w postaci róznorodnych konformerów. Czynniki te w znacznym stopniu utrudniają zaprojektowanie specyficznego receptora dla danej molekuły.
Jedną z szeroko stosowanych technik detekcji, w analityce medycznej, jest fluorescencja. Jej głównymi zaletami są: wysoka czułość, oraz krótki czas odpowiedzi z układu po związaniu analizowanej cząsteczki (cząsteczki „gościa“). Dzięki tym właściwościom może ona zostać wykorzystana do monitorowania stężenia analitu w czasie rzeczywistym, nawet w stężeniach nanomolowych [5]. Konstrukcja fluorescencyjnych sensorów bazuje zazwyczaj na motywie mostu donorowo-akceptorowego. Strukturalnie receptor zbudowany jest z dwóch części rozdzielonych linkerem. Pierwsza z nich służy jako jednostka odpowiedzialna za wiązanie analitu, natomiast druga daje sygnał do otoczenia w postaci zmiany fluorescencji (Rys.1).

 

Wczesne receptory oparte na strukturze kwasu antracenoboronowego, wykazywały niewielkie zmiany w intensywności fluorescencji po związaniu sacharydu. Dopiero wprowadzenie linkera w postaci grupy N-metylo-o-aminometylowej doprowadziło do powstania receptorów o pożądanych właściwościach fluorescencyjnych [6]. Obecność grupy aminowej w tych układach pełni dwojaką rolę. Wolna para elektronowa na atomie azotu wygasza fluorescencję poprzez fotoindukowany transfer elektronu (PET). Związanie cukru zwiększa kwasowość atomu boru i prowadzi do utworzenia wiązania B--N+, które zaburza PET [7]. Inną korzyścią płynącą z wprowadzenia grupy aminowej jest obniżenie pKa grupy boronowej, co w rezultacie umożliwia kompleksowanie cukrów już w pH fizjologicznym. Pomimo tego, iż receptory te wykazywały oczekiwaną zmianę w fluorescencji nie były wystarczająco selektywne. Wprowadzenie dodatkowej grupy boronowej do struktury receptora skutkuje zwiększeniem jego specyficzności substratowej. Za przykład może posłużyć związek (a - Rys. 2) zaprojektowany do selektywnego wykrywania glukozy. Stała wiązania tego cukru w pH 7,7 wynosi 4000 M-1 i jest niemal 30-krotnie większa niż dla fruktozy [6]. Struktura (2 - Rys. 2) przedstawia natomiast diboronowy receptor, rozpoznający kwasy sialilowe nadekspresjonowane na powierzchni błony komórek nowotworowych. Powstanie asocjatu daje odpowiedź w postaci „świecenia“ [8,9].


Pomimo wielu zalet oznaczanie analitów za pomocą fluorescencji ma również swoje wady. Wymaga ona specjalistycznych i drogich urządzeń oraz przeszkolonego personelu, co wyklucza wykorzystanie jej w prostych testach diagnostycznych.
Alternatywną może być zastosowanie związków dających odpowiedź widoczną w zakresie pasma światła widzialnego. Rosnące zainteresowanie tego typu sensorami ma podłoże praktyczne. Wynika to z potencjalnego zastosowania ich w paskowych testach diagnostycznych podobnych do uniwersalnych papierków wskaźnikowych. Możliwość bezinwazyjnego i prostego kontrolowania stężenia glukozy w płynach fizjologicznych mogłoby być dużym ułatwieniem, szczególnie dla osób cierpiących na cukrzycę. Receptory o takich właściwościach próbowano otrzymać poprzez modyfikację związków diazowych grupą boronową. Jednakże zmiana barwy jaką otrzymywano przed i po związaniu analitu nie dawała zadawalających rezultatów [7]. W związku z tym, postanowiono zastosować inne rozwiązanie i rozdzielić system na dwie niezależne składowe. Taki układ zbudowany jest z receptora oraz odwracalnie związanego z nim reportera. Cząsteczka gościa rywalizuje kompetencyjnie o miejsce wiązania z barwnikiem. Wypierany z kompleksu chromofor daje barwną odpowiedź, która jest proporcjonalna do ilości związanego analitu (Rys.3) [10].
Za przykład może posłużyć prosty test kolorymetryczny przedstawiony na rysunku nr 4. Polega on na związaniu zmodyfikowanego kwasu aryloboronowgo z alizaryną (ARS) i wytworzeniu asocjatu – pierwsza probówka od lewej. Po dodaniu cukru barwnik jest uwalniany z kompleksu i zmienia barwę roztworu z pomarańczowej na czerwoną.
Rozszerzeniem tej strategii jest polimeryzacja pochodnej kwasu fenyloboronowego a następnie wysycenie go ARS. W rezultacie otrzymuje żel reagujący zmianą koloru w obecności cukru [10].
Opisane wyżej metody detekcji przedstawiają klasyczne podejście w projektowaniu specyficznych receptorów dla indywidualnego analitu. Jest to często trudne, a czasem wręcz niemożliwe w przypadku związków zbliżonych strukturalnie. Rozwiązaniem problemu jest wykorzystanie macierzy jako sensorów, czyli konstrukcji czipów. Składają się one z wielu prostych receptorów, a każdy z nich tworzy pojedynczą komórkę. W układach tych wiele receptorów reaguje na jeden analit a wzorzec odpowiedzi wszystkich jest charakterystyczny dla danej substancji. Dla każdego związku można zatem stworzyć różnicową mapę kolorów będącą molekularnym odciskiem palca. Metoda ta ogranicza konieczność projektowania i syntezy skomplikowanych związków dla każdego analitu z osobna. Jako przykład może posłużyć macierz zbudowana z kombinacji 12 barwników, kwasów borowego i fenyloboronowego. Układ ten wykorzystano do rozróżnienia 14 różnych sacharydów w zakresie stężeń milimolowych [11]. Z powodzeniem udało się również zastosować tą technikę do określenia składu różnych kaw, piw czy też słodzików [11].


Zaawansowane metody detekcji poziomu glukozy
Dla diabetyków samodzielne monitorowanie poziomu glukozy we krwi jest kluczowe i wiąże się z uciążliwym, bolesnym i codziennym nakłuwaniem palców. Aby ułatwić pacjentom detekcję glukozy, nieustannie podejmuje się próby opracowania nieinwazyjnych metod, które w czasie rzeczywistym pozwolą na badanie poziomu tego cukru.
Łzy zwilżając rogówkę, chronią ją przed wysychaniem i utratą przezroczystości. Stanowią one również swoisty rezerwuar wielu molekuł o aktywności biologicznej takich jak Na+, K+, mocznik, cholesterol, histamina czy też glukoza. Rozwój systemów, wykorzystujących soczewki kontaktowe jako narzędzi do monitorowania stężenia metabolitów jest więc w pełni uzasadnione. W profilaktyce cukrzycy dodatkowym czynnikiem przemawiającym na korzyść nowej technilogii jest fakt, iż większość osób dotkniętych tą chorobą cierpi na zaburzenia widzenia,a istnieje prosta zalezność pomiędzy stężeniem glukozy we krwii i we łzach. Czas jaki musi upłynąć od zmiany ilości markera w tych dwóch płynach ustrojowych jest stosunkowo niewielki i wynosi około 10 minut [12].


Pierwsze próby zastosowania, znanych syntetycznych receptorów dla glukozy, nie dały oczekiwanych rezultatów w postaci zmiany barwy soczewki. Wynikało to z różnic pomiędzy, warunkami fizjologicznymi dla których były one projektowane, a tymi rzeczywiście panującymi w ludzkim oku. Największe rozbieżności zanotowano w obrębie pH. Okazało się bowiem, iż jest ono o około 1 jednostkę niższe, w odniesieniu do pH panującego we krwi i wynosi 6.2. Różnice dotyczyły również stężenia glukozy, które we łzach jest 10-krotnie mniejsze niż we krwi i waha się w zakresie od 5 mM do 250 mM [13]. Dlatego też, jako podstawową jednostkę budulcową soczewki konta-ktowej wybrano IV-rzędowe sole kwasu pirydynoboronowego. Zaletą tej grupy związków jest dużo niższe pKa grupy boronowej oraz większa trwałość tworzącego się w czasie kompleksowania estru. Zmiana gęstości elektronowej na atomie boru odpowiada za zmiany we fluorescencji, która odzwierciedla poziom glukozy we łzach. Fotoniczne kryształy oparte o strukturę kwasów boronowych, mody-fikowane odpowiednimi kompo-nentami mogą tworzyć żel. W kontakcie z cząsteczkami glukozy odstępy między łańcuchami polimeru ulegają zmianie, wpływając na to jak światło przechodzi przez materiał [14]. W ten sposób zostaje uzyskana zmiana barwy odwzorowująca stężenie analitu. Równolegle trwają badania nad opracowaniem „inteligentnego” tatuażu – specjalnego polimeru, który mógłby być umieszczany pod skórą. W odpowiedzi na rosnące się stężenie glukozy tatuaż reagowałby zmianą barwy lub świeceniem.

Podsumowanie
Kwasy boronowe ze względu na swoją unikalną właściwość tworzenia odwra-calnych estrów ze związkami poli-hydroksylowymi od lat są stosowane jako chemoreceptory dla węglowo-danów. Rozwój badań w tej dziedzinie z roku na rok skutkuje wzrostem ilości zastosowań aplikacyjnych układów opartych o grupę boronową. Otrzymywanie coraz bardziej specy-ficznych sensorów służących do detekcji indywidualnych cukrów w płynach fizjologicznych może pozwolić na zidentyfikowanie motywu wiążącego charakterystycznego dla danej reszty cukrowej. Oprócz zastosowania w diagnostyce chemicznej może to pozwolić na opracowanie nowej klasy kierowanych leków przeciwnowo-tworowych. Kwas boronowy będzie pełnił w nich rolę jednostki rozpo-znającej specyficzne sekwencje sacharydów na powierzchni komórki. Dzięki temu lek będzie selektywnie trafiał do chorobowo zmienionych miejsc, i niszczył komórki rakowe.
Kwasy boronowe mogą również znaleźć zastosowanie w analitycznych technikach rozdziału. Ich immobilizacja na różnych fazach stałych pozwala na specyficzną separację sacharydów oraz glikoprotein.

Podziękowania: Zadanie współfinansowane jest ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.

Cały artykuł wraz z literaturą w formacie pdf dostępny  redakcji openin.pl

Komentarze obsługiwane przez CComment